Desarrollo y caracterización de un modelo de cultivo 3D de células HepaRG en hidrogeles de colágeno: Aplicación al estudio de la hepatotoxicidad de tipo colestásico

Doctorando 
Enrique Timor López

Directoras de la tesis
Dra. María Teresa Donato Martín
Dra. Laia Tolosa Pardo

Unidad Mixta de Investigación en Hepatología Experimental

El daño hepático inducido por fármacos (DILI) constituye un grave problema de salud, con fuertes repercusiones clínicas y económicas. El hígado, al ser el principal órgano implicado en los procesos de detoxificación de fármacos, es una diana importante de su toxicidad, siendo la colestasis, es decir, la acumulación intra o extrahepática de ácidos biliares (BAs), un mecanismo frecuente. Entre los fármacos que inducen DILI colestásico se incluyen diferentes antibióticos, como es el caso de los β-lactámicos cloxacilina (CLO), flucloxacilina (FLU) y nafcilina (NAF), empleados en el ámbito hospitalario. El DILI se ha estudiado tradicionalmente mediante cultivos celulares bidimensionales (2D) que, aunque sencillos y reproducibles, han fallado en la predicción de la hepatotoxicidad de ciertos fármacos. En los últimos años, los sistemas de cultivo tridimensionales (3D) han ganado protagonismo al reproducir mejor la arquitectura y funciones hepáticas, y entre ellos, los hidrogeles, basados en la encapsulación celular en biomateriales como el colágeno, han demostrado gran utilidad.

De hecho, el colágeno tipo I, principal componente de la matriz extracelular hepática, favorece la polaridad y el mantenimiento del fenotipo de los hepatocitos. Aunque los hepatocitos humanos primarios son el gold standard en el estudio del DILI, su difícil acceso limita frecuentemente su uso. Por ello, la línea de carcinoma hepatocelular HepaRG, capaz de expandirse y de adquirir un fenotipo maduro tras un largo proceso de diferenciación en presencia de dimetilsulfóxido (DMSO), ha supuesto una alternativa interesante a este respecto.

En la presente tesis se ha desarrollado un modelo 3D basado en el cultivo de células HepaRG en hidrogeles de colágeno tipo I, con el fin de reducir el tiempo de cultivo necesario para su diferenciación y mejorar su funcionalidad. Se evaluaron la viabilidad a largo plazo, la expresión génica y proteica, y diversas funciones hepáticas (síntesis de urea, albúmina y BAs, detoxificación de fases I y II, transporte hepatobiliar y defensa antioxidante). Comparado con el modelo 2D convencional, el modelo 3D mostró un fenotipo más diferenciado y niveles funcionales significativamente superiores, en particular tras 14 días de cultivo con DMSO 1%. Una vez caracterizado el modelo 3D, se exploró la hepatotoxicidad inducida por los antibióticos CLO, FLU y NAF, y por bosentán como control positivo de daño colestásico.

El modelo 3D reprodujo la toxicidad colestásica esperada, mostrando mayor citotoxicidad en presencia de BAs y a exposiciones prolongadas de los fármacos. Además, los genes relacionados con los mecanismos de la colestasis se vieron afectados de manera dependiente de concentración, especialmente en presencia de BAs. Un análisis transcriptómico exhaustivo reveló que la CLO alteró de forma marcada la expresión de genes implicados en el metabolismo de BAs y en la defensa frente al estrés oxidativo y del retículo endoplasmático. También se observó que la CLO inducía enzimas de detoxificación y, al mismo tiempo, inhibía el transporte apical de BAs. A nivel funcional, la CLO incrementó el estrés oxidativo intracelular (calcio, superóxido mitocondrial y especies reactivas del oxígeno) y moduló negativamente vías de señalización proliferativas, aumentando en paralelo la fosforilación de p38, relacionada con la apoptosis.

En conclusión, el modelo 3D desarrollado en el presente trabajo constituye una herramienta válida, reproducible y funcionalmente superior al modelo 2D convencional para investigar el DILI asociado a antibióticos colestásicos, así como los mecanismos moleculares implicados. En el futuro, este modelo podría facilitar el desarrollo de fármacos más seguros, contribuyendo a una mejor prevención y manejo de la hepatotoxicidad.

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